Каталог :: Технология

: Технология производства низина. Антибиотические свойства низина

                                     Р Х Т У                                     
                               им. Д.И.Менделеева.                               
                     Технология производства низина.                     
                     Антибиотические свойства низина.                     
                                            Выполнила:                   
                                                    студентка группы Э-45
                                               Тимошкина Е.А.            
                                  10. 05. 1997                                  
                             НИЗИНЫ (NISINS).                             
Низины относятся к антибиотикам, которые образуются собственно бактериями.
Антибиотическое вещество - низин - выделен  из культуры молочнокислого
стрептококка Streptococcus lactis. Низин подавляет развитие ряда
грамположительных и некоторых кислотоустойчивых бактерий, не оказывает влияния
на грамотрицательные бактерии, дрожжи и плесневые грибы. Этот антибиотик
подавляет развитие многих микроорганизмов: пневмококки, группу стрептококков,
различные виды Bacillus , Clostridium, Mycobacterium tuberculosis,
Lactobacillus, Corynebacterium, немногие виды Streptomyces, Micrococcus
pyogenes. Низин не оказывает антимикробного действия на Escherichia
coli, Salmonella typhi, Shigella, некоторые виды Neisseria. 
Свойства низина, а также особенности его химического строения привлекли к этому
антибиотику внимание ученых. Что касается применения, следует отметить, что
низин не используется в медицинской практике, но с успехом применяется в
ветеринарии для лечения маститов у коров. Также имеет большое применение в
пищевой промышленности в качестве консерванта некоторых скоропортящихся
продуктов, а также для предупреждения порчи сыров. Есть сообщения об активности
низина в отношении малярийного плазмодия, но этот вопрос пока остается не до
конца изученным.
Строение низина.
Установлено, что низин имеет молекулярную массу, равную 3500, он может
полимеризоваться и образовывать димер (молекулярная масса 7000) и тетрамер.
Полимеризацию низина связывают с наличием в его молекуле дегидроаланина. В
состав молекулы низина входят 30 аминокислотных остатков следующих
аминокислот: лизин, гистидин, аспарагиновая кислота, серин, пролин, глицин,
аланин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, остатки редко встречающихся
серосодержащих аминокислот: лантионин и  b-метиллантионин, ненасыщенные
аминокислоты - дегидроаланин и  b-метилдегидроаланин.
В 1970 году установлена следующая структура молекулы низина:
H2N  - Иле - Мга - Ала - Иле - Дга - Лей - Ала - Амк - Про - Глу - Ала -
S                                              S
- Лиз - Амк - Гли - Ала - Лей - Мет - Гли - Ала - Асп - Мет - Лиз -
S
S
- Амк-Ала- Амк - Ала - Гис - Ала - Сер - Иле - Гис - Вал - Дга - Лиз - СООН
Дга - дегидроаланин; Амк - аминомасляная кислота; Мга -  b-метилдегид-
роаланин. Определено положение двух сульфидных мостиков, образованных
остатками  b-метиллантионина. Этот фрагмент имеет бициклическую структуру:
Биологическая активность низина обусловлена наличием в его молекуле
a,b-ненасыщенных аминокислот (дегидроаланин, b-метилдегидроаланин). Димеры и
тетрамеры низина, подобно мономеру, обладают биологической активностью. Низин
влияет на споры чувствительных к нему бактерий, которые более богаты катионами
по сравнению с вегетативными клетками, и выступает как катионитный
детергент. Низин, адсорбируясь на поверхности спор, в момент прорастания
спор нарушает прониаемость цитоплазматичесой мембраны и таким образом подавляет
рост развивающихся клеток бактерий. Этот антибиотик способен реагировать с
сульфгидрильными группами биологически важных соединений, выводя их из реакций
метаболизма.
     
     
               Технологические стадии производства низина.               
1.   Приготовление посевного материала.
Штаммы-продуценты
из пробирок
¯
в колбы со стерильной питательной средой на качалки, оптимальные tо и
рН=6.5 - 6.8.
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½                      ½
½
½
½
½
½
½
½
½
¯
Инокуляторы для наращивания посевного материала (малый посевной аппарат,
затем большой посевной аппарат; постоянный долив питательной среды)
¯
С понижением рН среды увеличивается выделение низина из клеток в
культуральную жидкость. При рН=4.3 более 90% низина выделяется в среду, а при
рН=6.8 выделяется 40% антибиотика.
ü Но интенсивная аэрация культуры молочнокислого стрептококка не оказывает
благоприятного влияния ни на рост бактерий, ни на образование низина.
     Питательная среда: в средах, содержащих недостаточное для нормального
развития количество азота (1-2 мг% NH2 при норме 29 мг%), сильно
снижается рост стрептококка и образование антибиотика. Лучшими азотсодержащими
компонентами в средах являются дрожжевой автолизат, пептон, казеиновый
гидролизат. Высокий выход антибиотика наблюдается при развитии молочнокислого
стрептококка на средах, содержащих аммонийные соли органических кислот.
     Источник углерода - глюкоза. Добавление к среде с глюкозой двух-, трех-,
четырех- и пятиуглеродных органических кислот способствует повышению роста
продуцента антибиотика и некоторому увеличению образования им низина.
При засеве свежей питательной среды культурой Streptococcus lactis 
вместе с посевным материалом вносится и низин, так как количество общего низина
в процессе развития бактерий снижается и к концу периода лаг-фазы клетки
стрептококка практически  не содержат антибиотика. А синтез низина происходит
после экспоненциального роста бактерий в период ранней стационарной фазы.
2.   Установка для биосинтеза антибиотика
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½          ½
½
½
½          ½
½
½
½
½
½
½          ½
¯
Снижение общего количества низина в лаг-период развития Streptococcus lactis 
и синтез антибиотика в более поздний период роста подтверждает значение низина в
качестве важной части бактериального ростового цикла стрептококка (низин,
по-видимому, связан с контролирующим механизмом, который не оказывает влияния
на скорость роста продуцента антибиотика, но задерживает начало роста новых
клеток). Снижение синтеза антибиотика к концу периода лаг-фазы обусловлено
изменением третичной структуры или степени полимеризации антибиотика. Этого
процесса инактивации низина можно избежать путем добавления в среду казеина, в
результате чего наблюдается стабилизация антибиотической активности и большое
образование низина. У низина в отличие от других полипептидных антибиотиков
путь синтеза сходен с путем образования белков, т.е. связан с рибосомным
механизмом. Синтез низина идет через образование низиноподобных
белков-предшественников биосинтеза антибиотика, причем превращение пренизина в
низин происходит под действием фермента на внешней поверхности клетки
стрептококка (есть предположение и о том, что ответственность за биосинтез
низина несут определенные плазмиды, в которых локализованы соответствующие гены
образование молекулы антибиотика). Сам механизм биосинтеза низина и его
молекулярная масса позволяют рассматривать этот антибиотик не как полипептид, а
как низкомолекулярный основной белок.
3. Стадия предварительной обработки культуральной жидкости, клеток
микроорганизма и фильтрации (отделения культуральной жидкости от биомассы
продуцента).
½          ½
½
½
½          ½
½
½
½
½
½
½          ½          ½          ½
¯
В результате рассмотренных аспектов биосинтеза видно, что образуемый антибиотик
почти полностью выделяется из клеток в культуральную жидкость (бóльшая
часть его). Тогда антибиотик выделяют из культуральной жидкости методами
экстракции растворителями, не смешивающимися с жидкой фазой, осаждают в виде
нерастворимого соединения или сорбируют ионообменными смолами. При содержании
антибиотика (как в нашем случае) в культуральной жидкости и в клетках
продуцента, первичной операцией его выделения является перевод антибиотика в
фазу, из которой наиболее целесообразно его изолировать.  При этом антибиотик,
содержащийся в культуральной жидкости, и клетки с антибиотическим веществом,
переводят в осадок, из которого антибиотик экстрагируют. Отделение нативного
раствора от биомассы и взвешенных частиц проводят методами фильтрации
(нутч-фильтр, друк-фильтр, сепараторы) или центрифугирования.
Стадия выделения и очистки антибиотика
¯
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
½
¯
Во избежание инактивации антибиотика под влиянием внешних факторов при его
выделении и очистке необходимо соблюдать максимальную осторожность.
Основные методы очистки:
     Метод экстракции (Многократный перевод антибиотика из одного растворителя
в другой с предварительным осаждением (кристаллизацией)).
     Ионообменная сорбция (Пропускание водного раствора антибиотика через
колонки с соответствующими ионообменными смолами, сорбция на них, а раствор с
примесями, имеющий противоположный антибиотику заряд, проходит через колонку.
Адсорбированный на смоле антибиотик элюируют, получают очищенный,
концентрированый препарат. А раствор можно вновь пропустить через ионообменную
смолу, но  с противоположным зарядом, тогда на смоле осядут примеси, а более
очищенный раствор пройдет через колонку.
     Осаждение (Связывание антибиотика с веществами с целью получения
соединения, выпадающего в осадок, который с помощью фильтров или
центрифугирования отделяют от нативного раствора, промывают, высушивают.
Образовавшееся соединение  растворяют и антибиотик экстрагируют или вновь
осаждают. )
Одна из стадий очистки - концентрирование полученных растворов (отгонка
большей части растворителя в вакууме).
Стадия сушки, получение готовой продукции, изготовление лекарственных форм 
(биологический и фармакологический контроль), расфасовка.
Виды сушки: лиофильная сушка (при температуре -8, -12 °С)
     распылительная сушилка (раствор антибиотика пневматически распыляется до
мельчайших капель в камере с потоком нагретого воздуха)
     сушка в вакуум-сушильных шкафах (для высушивания зернистых и
пастообразных антибиотических препаратов).
Расфасованный и упакованный антибиотик с указанием показателя биологической
активности, даты выпуска и срока годности поступает в продажу.