Каталог :: Медицина

Курсовая: Кровь

                                 Введение                                 
Постоянно циркулируя в замкнутой системе кровообращения, кровь объединяет
работу всех систем организма и поддерживает многие физиологические показатели
внутренней среды организма на определенном, оптимальном для осуществления
обменных процессов уровне. На основе циркуляции форменных элементов и со
ставных веществ плазмы кровь выполняет в организме разносторонние жизненно
важные функции: дыхательную, трофическую, защитную, регуляторную,
выделительную и другие. Конкретное понимание многочисленных функций крови
возможно лишь на основе изучения строения и свойств ее основных компонентов —
форменных элементов и плазмы. (Александровская и др.,1987)
Снижение до минимума возможных ошибок и обеспечение высокого качества
гематологических исследований возможно при стандартизации преаналитического и
аналитического этапов работы. Изменения клеточного состава периферической
крови наблюдается как при патологии, так и в различных физиологических
состояниях организма. На показатели крови могут оказывать влияние физическая
и эмоциональная нагрузка, сезонные, климатические, метеорологические условия,
время суток, прием пищи, курение и т. д. Так при интерпретации результатов
необходимо учитывать такие данные, как возраст, пол, активность пациента и
положение его тела в момент взятие крови. (Луговская, 2001)
Цель курсовой работы это ознакомление и познание  методов изучения клеточного
состава крови. Основные задачи это изучить методы исследования клеточного
состава крови: эритроцитов, лейкоцитов и кровяных телец, а также работа с
литературой касающейся непосредственно данной темы.
                    Глава 1.Клеточные компоненты крови                    
Внутрисосудистая кровь — подвижная тканевая система с жидким межклеточным
веществом — плазмой и форменными элементами — эритроцитами, лейкоцитами и
кровяными пластинками (тромбоцитами — у птиц и низших позвоночных).
Гистогенетически, структурно и функционально сосудистая кровь является частью
системы крови и тесно связана с органами кроветворения и кроверазрушения,
рыхлой соединительной тканью и другими тканями и органами. (Александровская и
др., 1987)
     1.1 Эритроциты
Эритроциты  — красные кровяные клетки. У человека это мелкие клетки, лишенные
ядра и имеющие форму двояковогнутых дисков. Средний диаметр эритроцитов
составляет 7—8 мкм и приблизительно равен диаметру кровеносных капилляров.
Специфическая форма эритроцита обусловливает более высокое отношение
поверхности к объему, что увеличивает возможности газообмена. Толщина
отдельного эритроцита очень мала, и это облегчает диффузию газов с
поверхности внутрь клетки. Благодаря эластичности своей мембраны эритроцит
может проходить через капилляры, просвет которых меньше его диаметра.
Процесс образования эритроцитов носит название гемопоэза (эритропоэза) или
кроветворение, а ткань, в которой он происходит, называют кроветворной или
гемопоэтической. У младенцев кроветворная ткань содержится во всех костях, а
у взрослых людей главными местами образования эритроцитов являются кости
черепа, рёбра, грудина, позвонки, ключицы и лопатки. В 1 мл крови содержится
около 5 млн. эритроцитов, но эта величина варьирует в зависимости от
возраста, пола и состояния здоровья.
Важнейшая особенность эритроцитов - присутствие в них гемоглобина, который
обратимо связывает кислород (превращаясь в оксигемоглобин) в участках с высокой
концентрацией 02 и отдает его в участках с низкой концентрацией 0
2. В эритроцитах содержится также фермент карбоангидраза, участвующий в
транспорте углекислоты.
Продолжительность жизни эритроцитов у взрослых людей оставляет около трех
месяцев, после чего они разрушаются в печени или селезенке. Белковые
компоненты эритроцита расщепляются на составляющие их аминокислоты, а железо,
входящее в состав гема, удерживается печенью и хранится в ней в составе
ферритина (белка, связывающего железо). Железо может в дальнейшем
использоваться повторно при образовании новых эритроцитов и при синтезе
цитохромов. Остальная часть молекулы гема расщепляется с образованием желчных
пигментов билирубина и биливердина. Оба пигмента в конце концов выводятся с
желчью в кишечник.
Каждую секунду в организме человека разрушается от 2 до 10 млн. эритроцитов.
Скорость распада эритроцитов и замещение их новыми зависит от содержания в
атмосфере кислорода, доступного для переноса кровью. Низкое содержание
кислорода в крови стимулирует костный мозг, и в нем образуется больше
эритроцитов, чем разрушается в печени. Этот механизм служит одним из путей
акклиматизации млекопитающих к пониженному содержанию кислорода в атмосфере
на больших высотах. При высоком содержании кислорода наблюдается
противоположная картина. (Грин и др., 1990)
     1.2 Лейкоциты
Лейкоциты крупнее эритроцитов, но содержатся в крови в гораздо меньшем
количестве (около 7000 в 1 мл крови). Они играют важную роль в защите
организма против болезней. Все лейкоциты имеют ядро. Несмотря на наличие
ядра, продолжительность жизни лейкоцитов в кровяном русле составляет в норме
всего лишь несколько дней. Существуют две основные группы лейкоцитов —
гранулоциты (зернистые лейкоциты) и агранулоциты (незернистые лейкоциты).
Гранулоциты (зернистые, или полиморфноядерные, лейкоциты) образуются в
костном мозге, но не из тех клеток, из которых образуются эритроциты. Все
гранулоциты содержат разделенное на лопасти ядро и зернистую цитоплазму и
обладают способностью к амебоидному движению. Гранулоциты можно далее
подразделить на нейтрофилы, эозинофилы и базофилы.
Нейтрофилы (фагоциты) составляют 70% всех лейкоцитов. Они обладают
способностью проходить между клетками, образующими стенки капилляров, и
проникать в межклеточные пространства тканей (процесс, называемый диапедезом)
и направляться к инфицированным участкам тела. Нейтрофилы — активные
фагоциты, они поглощают и переваривают болезнетворные бактерии.
Эозинофилы содержат цитоплазматические гранулы, окрашиваемые эозином в
красный цвет. Обычно они составляют всего лишь 1,5% общего числа лейкоцитов,
но при аллергических состояниях (на пример, астме или сенной лихорадке) их
количество возрастает. Как полагают, эозинофилы обладают антигистаминным
действием. Содержание эозинофилов в крови контролируется гормонами коры
надпочечников. (Грин и др.,1990)
Базофилы - самая малочисленная разновидность гранулоцитов периферической
крови животных, составляют 0,5% популяции лейкоцитов. Они вырабатывают
фармакологически активные вещества -  гепарин и гистамин; содержат гранулы,
которые окрашиваются в синий цвет основными красителями типа метиленового
синего. Базофилы участвуют в иммунологических реакциях организма, в частности
в реакциях аллергического типа. (Александровская,1987)
Агранулоциты (одноядерные лейкоциты) содержат ядро овальной формы и
незернистую цитоплазму. Существуют два основных типа агранулоцитов: моноциты
и лимфоциты.
Моноциты (4%) образуются в костном мозге и содержат ядро бобовидной формы.
Активно фагоцитируют (поглощают) бактерий и другие крупные частицы. Способны
мигрировать сквозь стенки капилляров в очаги воспаления, где действуют так
же, как нейтрофилы.
Лимфоциты (24%) образуются в тимусе (вилочковой железе) и лимфоидной ткани из
клеток предшественниц, поступающих из костного мозга. Имеют округлую форму и
содержат очень мало цитоплазмы. Способность к амебоидным движениям
ограниченна. Главная функция  — индукция иммунных реакций или участие в них
(образование антител, отторжение трансплантата, уничтожение опухолевых
клеток). Продолжительность жизни варьирует от нескольких дней у грызунов до
десяти и более лет у человека. (Грин и др., 1990)
     1.3 Кровяные пластинки
Кровяные пластинки представляют собой фрагменты клеток, имеющие неправильную
форму, окруженные мембранной и обычно лишенные ядра. Они образуются из
крупных клеток костного мозга, называемые мегакариоциты. Играют важную роль в
инициации свёртывания крови. В 1 мл крови содержится около 250
000тромбоцитов.
В сосудистой крови пластинки существуют около 9—10 суток, после чего
происходят их фагоцитоз, главным образом макрофагами селезенки.
Тромбоциты имеют важнейшее значение в обеспечении основных этапов Остановки
кровотечения — гемостаза. На месте повреждения эндотелия стенки сосуда и
обнажения базальной мембраны происходит оседание и агрегация пластинок. По
следующая их активация сопровождается изменением формы (пластинки становятся
шаровидными) и выделением ряда соединений, содержащихся в гранулах
(тромбоцитарные факторы), которые ускоряют агрегацию пластинок. Кровяные
пластинки крови кроликов выделяют значительное количество гистамина. В
результате агглютинации все новых и новых пластинок образуется сгусток (белый
тромб), препятствующий выхождению форменных элементов крови из поврежденного
сосуда. Вследствие изменения поверхности кровяных пластинок активируются
факторы свертывания, находящиеся в плазме крови, которые приводят к появлению
нерастворимого фибрина, заполняющего пространства между коагулированными
пластинками. В последующей ретракции кровяного сгустка имеет значение
содержащийся в пластинках тромбостенин (сократительный белок).
(Александровская, 1987)
          Глава 2. Методы исследования клеточного состава крови.          
     2.1 Метод подсчета количества эритроцитов.
Наиболее распространен классический микроскопический метод подсчета клеток в
камере Горяева.
Принцип: Подсчет эритроцитов под микроскопом  в определенном количестве
квадратов счетной сетки с последующим пересчетом на 1 мкл крови, исходя из
объёма квадратов и разведения крови.
Ход определения: Исследуемую кровь разводят в 200 раз, для чего в пробирку с
4 мл 0,9% раствор хлорида натрия добавляют 20 мкл крови. Кончик пипетки
вытирают фильтровальной бумагой или марлей, и кровь выдувают на дно пробирки.
Пипетку тщательно промывают в верхнем слое жидкости, содержимое пробирки
перемешивают и оставляют стоять до момента подсчета. К счетной камере
притирают шлифовонное стекло и заполняют ее разведенной кровью.
Предварительно несколько раз тщательно встряхивают содержимое пробирки, затем
стеклянной или пластиковой пастеровской пипеткой (Deltalab) или стеклянной
палочкой отбирают каплю разведенной крови и подносят ее к краю покровного
стекла, следя за тем, чтобы она равномерно без пузырьков воздуха заполнила
всю поверхность камеры с сеткой, не затекая в бороздки. Заполненную камеру
оставляют в горизонтальном положении на 1 мин (для оседания эритроцитов).
Подсчет эритроцитов производят в 5 больших квадратах, разделенных на 16
малых, т.е. в 80 малых квадратах. Рекомендуется считать клетки в квадратах
сетки, расположенных по диагонали. Для того чтобы не считать одни и те же
эритроциты, лежащие на линиях, принято считать клетки только на определенных
двух линиях (например, на левой и верхней).
Расчет количества эритроцитов в 1 мкл крови производят, исходя из разведения
крови (200), числа сосчитанных квадратов (80) и объема 1 малого квадрата
(1/4000 мкл), по формуле:
     
где Х - число эритроцитов в 1 мкл крови; а - число сосчитанных эритроцитов.
Эритроциты рекомендуется считать в течение 2-З часов после взятия крови. При
гемолитических и мегалобластных анемиях - сразу после взятия, так как
эритроциты легко разрушаются.
Ручные методы подсчета клеток чрезвычайно трудоемки и не всегда дают
достаточно точные результаты, так как при визуальном подсчете постоянно
присутствует субъективный фактор. Кроме того, малейшие отклонения от правил
подготовки камеры и подсчета клеток влияют на конечный результат
исследования. Вместе с тем, эти методы не требуют сложного оборудования,
реактивов и могут быть применены практически в любых условиях.
Основными источниками ошибок при подсчете эритроцитов являются:
•Неточное взятие крови в пипетку.
•Образование сгустка, поглощающего часть клеток и занижающего результат
исследования.
•Недостаточное перемешивание содержимого пробирки перед заполнением камеры.
•Неправильная подготовка камеры: недостаточное притирание покровных стекол;
неравномерное заполнение камеры, образование пузырьков воздуха.
•Подсчет эритроцитов сразу после заполнения камеры, не выжидая 1 минуту.
•Подсчет меньшего, чем требуется по методике, количества квадратов.
•Плохо вымытые камера, пробирки, пипетка, капилляр для взятия крови;
недостаточно просушенные пробирки и пипетки.
• Использование недоброкачественного разводящего раствора. (Луговская и др.,
2001)
     2.2 Метод подсчета количества лейкоцитов.
Определение количества лейкоцитов в счетной камере: Подсчет лейкоцитов под
микроскопом проводят после лизирования эритроцитов в 100 больших квадратах
счетной сетки и пересчитывают на 1 л крови, исходя из объема квадратов и
разведения крови. Подсчет лейкоцитов должен быть произведен в течение 2-4 ч
после взятия крови.
Реактивы: 3-5% раствор уксусной кислоты, подкрашенный несколькими каплями
раствора метиленового синего (для окраски ядер лейкоцитов). Раствор голубого
цвета, длительно годен к употреблению.
Ход определения: В пробирку с 0,4 мл уксусной кислоты набирают из пальца 20
мкл крови (разведение 1:20). Можно использовать стабилизированную
антикоагулянтом венозную кровь. Выдувают кровь из пипетки на дно пробирки,
затем тщательно перемешивают, повторно ее набирая и выдувая. Заполненную
камеру оставляют в горизонтальном положении на 1 мин (для оседания
лейкоцитов). Лейкоциты подсчитывают в 100 больших квадратах с малым
увеличением (окуляр 10х, объектив 8х). Для большей точности счет лейкоцитов
проводят по всей сетке в больших квадратах (неразделенных на малые квадраты и
полосы), начиная с левого верхнего угла сетки. Для лучшего контрастирования
затемняют поле зрения, опуская конденсор и закрывая диафрагму.
Расчет числа лейкоцитов проводят по формуле:
       
где Х — число лейкоцитов в 1 мкл крови, а - число лейкоцитов в 100 больших
квадратах, 20 — разведение крови, 100- число подсчитанных квадратов, 250
—объем одного большого квадрата 1/250.
Таким образом, количество лейкоцитов, подсчитанных в 100 больших квадратах,
умножают на 50.
При наличии в периферической крови ядросодержащих клеток красного ряд, они не
лизируются и подсчитываются вместе с лейкоцитами. В этом случае, чтобы
определить истинное количество лейкоцитов, из общего числа посчитанных клеток
вычитают количество клеток красного ряда.
Например: Общее количество лейкоцитов при подсчете в камере (или на анализаторе)
– 45*109/л. При подсчете лейкоцитарной формулы найдено, что на 100
лейкоцитов присутствует 50 эритробластов (нормобластов).
Рассчитываем истинное количество лейкоцитов в крови:
150 клеток (общее количество        -        45*109/л (количество
клеток в 1 мкл, лейкоцитов и нормобластов,                       полученное при
подсчете в камере полученное при подсчете                             или на
анализаторе)
лейкоцитарной формулы)
100 клеток (лейкоциты)                 -          Х (истинный лейкоцитоз крови)
                    
Таким образом, истинное число лейкоцитов в крови составляет 30 * 109/л.
Основные источники ошибок при подсчете лейкоцитов в камере:
• Неправильное соотношение объемов крови и уксусной кислоты, взятые в пробирку.
• Неправильно подготовленный раствор уксусной кислоты (при концентрации
большей, чем 5%, часть лейкоцитов может лизироваться, что приведет к
занижению результата).
•Длительное нахождение пробы при температуре выше 28°С, что может ускорить лизис
лейкоцитов в образце и привести к занижению результата.
•Неправильное заполнение камеры Горяева. Как и при подсчете эритроцитов,
камеру необходимо оставлять на 1 минуту для оседания клеток.
•Недостаточно хорошо отмытая после предыдущего определения камера Горяева.
Оставшиеся в камере лейкоциты могут завышать результаты анализа. (Луговская и
др., 2002)
     2.3 Методы подсчета количества тромбоцитов. 
Для определения количества тромбоцитов используют следующие методы: подсчет в
счет ной камере, мазках крови и гематологическом анализаторе. Каждая группа
методов имеет преимущества и недостатки.
Подсчет тромбоцитов в камере достаточно точен, не требует для расчета
количества эритроцитов. С другой стороны этот метод более трудоемкий,
поскольку тромбоциты в нативном виде представлены мелкими и плохо
контрастированными элементами. Недостаток метода в необходимости подсчета
тромбоцитов в ближайшие часы после взятия крови.
Определение количества тромбоцитов в мазках крови значительно уступает по
своей точности камерному методу или автоматическим счетчикам. Ошибки при
подсчете в мазках крови могут быть обусловлены плохим качеством мазка и
связанным с этим неравномерным распределением тромбоцитов, неточным
определением количества эритроцитов крови. Существенное неудобство метода -
необходимость одновременного подсчета тромбоцитов и эритроцитов в крови.
Преимущество его - возможность исследования тромбоцитов в любое время,
независимо от момента взятия крови.
Метод определения тромбоцитов с помощью гематологического анализатора
позволяет достаточно точно определить количество тромбоцитов, их средний
объем и распределение по объему. (Луговская и др., 2002)
Метод подсчета в камере.
Принцип: Определение количества тромбоцитов в 1 л крови с учетом ее
разведения и объема квадрата счетной сетки камеры Горяева с применением
фазово-контрастного устройства для контрастирования тромбоцитов.
Реактивы: Применяют 1% раствор оксалата аммония, который быстро и полностью
лизирует эритроциты. Раствор кипятят и фильтруют. Хранят в холодильнике.
Ход определения: Исследуемую кровь разводят в 200 раз; для этого в сухую
пробирку набирают 4 мл реактива и 0,02 мл крови. Перемешивают и оставляют на
25-ЗО мин для гемолиза эритроцитов. Подготавливают счетную камеру.
Перемешивают разведенную кровь и заполняют камеру: подносят каплю крови с
помощью стеклянной палочки или пастеровской пипетки к краю покровного стекла,
следя за тем, чтобы кровь равномерно без пузырьков воздуха заполняла всю
поверхность сетки, не затекая в бороздки. Помещают счетную камеру во влажную
камеру на 5 мин для оседания тромбоцитов (чашка Петри с уложенной по краям
смоченной водой фильтровальной бумагой). Подготавливают фазово-контрастное
устройство в соответствии с инструкцией, приложенной к нему. Тромбоциты
считают в 25 больших квадратах.
Тромбоциты выглядят в счетной камере в виде мелких, хорошо преломляющих свет
образований.
Расчет тромбоцитов проводят по формуле:
          ,          
где Х - число тромбоцитов в 1 мкл крови; а - число тромбоцитов, сосчитанных в
25 больших квадратах, 200 - разведение крови, 25 - число сосчитанных
квадратов, 250 - объем одного большого квадрата 1/250 мкл. Число подсчитанных
тромбоцитов умножают на 2000.
Воспроизводимость. Ошибка метода составляет 6,5%. (Клиническая лабораторная
аналитика, 1999)
Метод подсчета в мазках крови (по Фонио).
Принцип: Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных мазках
крови на 1000 эритроцитов с расчетом на 1 мкл (или 1 л) крови, исходя из
содержания в этом объеме количества эритроцитов.
Реактивы: Применяют 14% раствор сульфата магния или 6% раствор
этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА).
Ход определения: Реактив набирают в капилляр Панченкова до метки “75 и вносят
в пробирку, затем добавляют кровь, взятую тем же капилляром, до метки “0”.
Содержимое пробирки перемешивают и готовят тонкие мазки. Фиксируют и
окрашивают по Романовскому-Гимзе в течение 2-3 ч (при использовании раствора
сульфата магния) и в течение 30-45 мин (при приме нении ЭДТА). Высохшие мазки
микроскопируют с иммерсионным объективом, подсчитывая количество тромбоцитов
в тонких местах препарата (эритроциты должны быть расположены разрозненно).
Подсчет проводят следующим образом: в каждом поле зрения микроскопа считают
число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут
просчитаны 1000 эритроцитов.
Расчет: количество тромбоцитов на 1000 эритроцитов составляет А‰ Зная число
эритроцитов в 1 л крови, подсчитывают количество тромбоцитов в 1 л крови.
Например: А=60‰; число эритроцитов 5 *1012
Составляют пропорцию:       60         -        1000
Х          -         5*1012/л, откуда
                    
Нормальные величины тромбоцитов 180,0-320,0 * 109/л
В настоящее время существуют готовые наборы для подсчета тромбоцитов (фирма
«Гем»). (Луговская и др., 2002)
     
                               Заключение.                               
Для подсчета и анализа клеток крови используют ручные микроскопические методы
и гематологические счетчики разного уровня автоматизации. В настоящее время
необходимо внедрение технологий автоматического изучения клеточного состава
крови, для того чтобы добиться высокого качества и точности исследований,
исключая ошибки, зависящие от работы лаборантов. Клинические лаборатории
нуждаются в разработке новых более совершенных методов.
За последние 15 лет произошло существенное развитие технологий и аппаратуры
для автоматического исследования клеток. В некоторых странах мира
автоматический анализ крови почти полностью заменил ручные и
полуавтоматические. (Луговская и др., 2002)
                            Список литературы.                            
1.                            Александровская О.В., Радостина Т.Н., Козлов
Н.А. Цитология, гистология и эмбриология. – М: Агропромиздат, 1987 – 448 с.
2.                            Грин Н. , Стаут У., Тейлор Д.  Биология. – М:
Мир, 1990. – Т. 3, №2. – С. 193 с.
3.                            Клиническая лабораторная аналитика //под ред.
Меньшикова В.В. – М: 1999. – т 2.
4.                            Луговская С.А., Морозова В.Т., Почтарь М.Е.,
Долглов В.В. Лабораторная гематология. – М: Юнимед-пресс, 2002. – 115 с.
5.                            Луговская С.А. Лабораторная гематология. – М:
Лаборатория, 2001 - №2  2-3 с.