Каталог :: Медицина

Курсовая: Определение острой токсичности экстракта молочая Полласа

            Министерство Здравоохранения и медицинской промышленности            
                   Государственное Образовательное Учреждение                   
                 Читинская Государственная Медицинская Академия                 
                          

Кафедра фармакологии

Курсовая работа «Определение острой токсичности экстракта Молочая Палласа» Выполнили: Студенты 332 группы Базырова А.В. Климова И.А. Хмелёва А.Н. 336 группы Хамула П.В. Научный руководитель Асс. кафедры фармакологии К.м.н. Кривошеева Е.М. г. Чита, 2004 1. Вводная часть. Молочай Палласа – Euphorbia pallasii (Молочай Фишера, Мужик-корень). Молочай Палласа назван по имени известного естествоиспытателя и ученого Палласа, изучавшего долгие годы свойства этого замечательного растения. Молочай Палласа – многолетнее травянистое растение, распространен в Юго- восточных районах Забайкалья: Читинском, Шилкинском, Оловянинском, Нерчинско- Заводском, Восточной Сибири, Северной Монголии, Китае. (1,4,6,7,9,10,11-18) При изучении химического состава в корнях обнаружены сапонины, флавоноиды, дубильные вещества, смолы (8%), горькие экстрактивные вещества, аскорбиновая кислота, крахмал, алкалоиды, токсины, углеводороды, кумарины, гликозиды, большое содержание селена, феногликозиды, лактоны с антибактериальной и противоопухолевой активностью, эуфорбон и антрагликозиды. Последние два вещества являются носителями токсичности. (2,3,5,8,19). Следует также отметить биологическое действие некоторых химических веществ, входящих в состав корня, на организм человека. Выраженное антиоксидантное свойство позволяет использовать препараты Молочая Палласа для профилактики онкологических заболеваний, провоцируемых химическими воздействиями и радиацией (селен, сапонины, флавоноиды). Проявление противоопухолевой активности (сапонины, дубильные вещества) используется для лечения многих онкологических заболеваний. (12) Стимулируя образование антител препараты повышают защиту организма от инфекционных и простудных заболеваний, что обуславливает их антимикробную, антивирусную, бактерицидную, фунгицидную активность (селен, алкалоиды,сапонины). Поэтому в народной медицине им издавна лечили туберкулез лимфатических узлов, костей и суставов, эхиноккокоз печени, венерические заболевания. В китайской медицине корни, обработанные в уксусной кислоте, используют для лечения туберкулеза лимфатических узлов, хронического бронхита. Концентрированный отвар в виде маслянистой жидкости используют в качестве растирки для лечения туберкулеза кожи, нейродермитов. Порошком корня присыпают язвы, фурункулы, ожоги. (12) Противовоспалительное действие препаратов корня позволяет использовать их для лечения воспалительных заболеваний слизистых оболочек ротовой полости, носа, зева, гортани, кишечника (дубильные вещества, алкалоиды). (12) Вытяжки из растений стимулируют кроветворение, действуя на центральные органы кроветворения, особенно на эритроцитарный росток (селен), поэтому он используется также для лечения всех видов анемий, для восстановления крови после лучевой и химиотерапии у онкологических больных. Сапонины и алкалоиды, содержащиеся в корне, стимулируют дыхание и контролируют деятельность желез дыхательных путей, что используется для лечения болезней дыхательной системы. Препараты Молочая Палласа способствуют растворению и выведению камней из мочевых путей при мочекаменной болезни, обладают мочегонным действием, а также используются для профилактики и лечения болезней почек, мочевого пузыря (антрагликозиды). (12) Спиртовые настойки, применяемые из-за сильной ядовитости по каплям, усиливают эрекцию и половое влечение, способствуют поддержанию и продлению сексуальной активности (селен). Почти половина селена, содержащегося в мужском организме, находится в семенных канальцах яичек. Он теряется с эякулятом, поэтому для мужчин ведущих активную сексуальную жизнь, потребность в этом микроэлементе выше, чем для женщин. В народной медицине им лечили импотенцию и аденому. (12) Помимо вышеперечисленных эффектов вещества, входящие в состав корня, проявляют Р-витаминную активность (дубильные вещества, флаваноиды); понижают никотиновую абстиненцию, усиливают тонус матки и скелетных мышц, обладают спазмолитическим, болеутоляющим ( сапонины, алкалоиды)действием, понижают кровяное давление, оказывают транквилизирующий эффект (алкалоиды); обладают антиаритмическим, успокаивающим, кардиотоническим, капилляроукрепляющим (сапонины,флаваноиды). (12) Способствуют понижению отрицательного влияния на организм токсических химических соединений и радиоизлучений. Способствуют выведению из организма солей тяжелых металлов, радионуклеотидов, Их применяют при отравлении тяжелыми металлами и алкалоидами (дубильные вещества, флаваноиды). (12) Сок применяют для уничтожения бородавок, мозолей, пигментных пятен на лице. В народной медицине Забайкалья ценится как «кровоочистительное», тонизирующее и стимулирующее средство женьшенеподобного действия, им издавна лечили эпилепсию, экзему, язву желудка. Молочай Палласа обладает слабительным и рвотным действием. Верхняя часть корня вызывает рвоту, а нижняя диарею. Вызывают потерю аппетита и расстройство пищеварения. Также обладают вяжущим действием при острых и хронических диареях, энтероколитах. При передозировке препаратов причиной отравления являются антрагликозиды. Признаки отравления: тошнота, рвота, кровавый понос. Для ликвидации симптомов рекомендуют пить много молока и глотать кусочки льда. (12) 2. Методы исследования. Определение острой токсичности по методу Кербера. Для расчета ЛД50/ЕД50 достаточно, чтобы было испытанно всего 4-5 доз, включая с одной стороны, дозу, не вызвавшую эффекта ниу одного животного в группе и, с другой стороны – дозу, вызвавшую эффект у всех животных группы. Опыт был поставлен на белых мышах в возрасте 2 – 2.5 мес. массой 20-35 г. Наблюдали выживаемость в течении 2 суток и через 2 недели (по Т.А. Гуськовой ). Экстракт вводили внутрибрюшинно в кличестве 0.2 мл. Для определения ЛД 50/ЕД50 в каждой группе было взято одинаковое число белых лабораторных мышей, равное 6. S ( Z ´ d ) Расчет ведется по формуле: ЛД50 = ЛД100 - m где ЛД100 – доза, вызывающая смертельный исход у всех животных данной группы; d – интервал между двумя рядом стоящими дозами; z – средняя арифметическая величина, полученная от деления количества погибших животных от двух смежных доз; m – число животных для каждой дозы. Методика изготовления гистологических препаратов. Для гистологии использовались кусочки органов размером 1,5´2 см. В нашем опыте размеры органов не превышали данных параметров, поэтому органы мышей были взяты целиком. 1 этап – фиксация формалином течении одного часа на водяной бане. 2 этап – обезжиривание в 96% спирте в течении 1 суток. 3 этап – уплотнение в хлороформе №1 40 минут, и в хлороформе №2 40 минут. Затем органы помещали в смесь хлороформа и парафина двукратно по 40 минут в термостате. 4 этап - заливка органов парафином и изготовление блоков. 5 этап – резка гистологического материала. Полученный срез приклеивается на предметное стекло с помощью белка с глицерином (стекла готовятся заранее – моются и обезжириваются и наносятся тонким слоем вышеуказанная смесь и равномерно растирается по стеклу). Срезы расправляют в теплой воде при помощи металлической иглы и натягиваются на предметное стекло и прижимаются к стеклу фильтрованной бумагой. Фиксируется на пульте. 6 этап – депарафинирование с помощью ксилола. Чтобы в последующем удалить ксилол, стекло со срезом ставят на пять минут в 96% спирт. 7 этап –окраска гематоксилином С помощью гематоксилина окрашиваются ядра клеток. 8 этап - дифференцировка в соляно-кислом спирте. 9 этап - окрашивание в эозине – для выявления цитоплазмы. 10 этап – обезвоживание в спирте двухкратно (используется два спирта одинакового процента). 11 этап - просветления срезов карбол-ксилолом и ксилолом. Срезы заливаются бальзамом и покрываются покровным стеклом. 3.Экспериментальная часть. Определение острой токсичности у мышей. Экстракт №1 (спиртовой с трехкратной очисткой ацетоном). Опыт №1(16.12.2003). Экстракт в дозе 3300 мг/кг, ввели внутрибрюшинно 1-ой мыши. В данном опыте мышь выжила. Реакция на введение экстракта.

Через 3 мин

Мочеиспускание

через 10 мин

ЧСС=160 ударов в мин

Через 15 мин

Миоклонус задних лапок и «умывание»

Через 20 мин

Дыхание по типу Чейн-Стокса,

Диафрагмальные судороги

Поведение.
0-15 мин

Беспокойство,

повышенная двигательная активность

15-40 минЗаторможенность, сидит в одном положении, при судорогах единичные шаги вперед, дефекация, симптомы «корчи» (местнораздражающее действие)
Через 60 мин

Усиленное «умывание»

Опыт№2 (17.12.2003) Ввели внутрибрюшинно 6-ти мышам экстракт в дозе 7000 мг/кг. Через 2 суток погибло 4 мыши, а через 4 – еще одна. Реакция на введение экстракта.
Через 3 минМочеиспускание

Через 10 мин

Дефекация
Через 15 минсимптомы «корчи»
Через 20 минЧДД=172 в мин, заваливание на бок

Через 26 мин

Единичные судороги
Через 50 минЛежачее положение ЧСС=48 ударов в мин, генерализованные судороги (подпрыгивание)
Через 52 минСудороги
Через 55 минСмерть
Определение массы органов.
№п/пМасса тела, мгМасса сердца, мгМасса печени, мгМасса легких, мгМасса почек, мгМасса селезенки, мг
128001881237384396119
226001571544232369274
324001401157198421250
424001411229332425258
M ± m2550± 96,8146±5,81291,7± 27,3286,5± 51,8402,7± 13,5225,25± 8,2
Опыт №3 (17.12.2003). Ввели внутрибрюшинно 6-ти мышам экстракт в дозе 3500 мг/кг. Через 2 суток погибло 4 мыши, выжило 2. Определение массы органов.
№п/пМасса тела, мгМасса сердца, мгМасса печени, мгМасса легких, мгМасса почек, мгМасса селезенки, мг
128002041345380460284
Опыт №4 (19.12.2003). Ввели внутрибрюшинно 6-ти мышам экстракт в дозе 1750 мг/кг. Через 2 суток погибло 2 мыши, выжило 4. Определение массы органов.
№п/пМасса тела, мгМасса сердца, мгМасса печени, мгМасса легких, мгМасса почек, мгМасса селезенки, мг
12400158853231276110
220001171139225248126
M ± m2200± 250137,5± 25,6996± 178,7228±3,7262± 17,6118±10,0
Опыт №5 (20.01.2004). Ввели внутрибрюшинно 1-ой мыши экстракт в дозе 87,5 мг/кг. Мышь выжила. Определение массы органов.
№п/пМасса тела, мгМасса сердца, мгМасса печени, мгМасса легких, мгМасса почек, мгМасса селезенки, мг
12300125106250429470
Экстракт №2 (действующее начало, выделенное из корня молочая Палласа). Опыт №1 (14.01.2004). Ввели внутрибрюшинно 6-ти мышам экстракт в дозе 3700 мг/кг. Через 2 суток погибло2 мыши, через 5 суток погибла 1 мышь, через 12 дней погибла 1 мышь, всего погибло 4 мыши. Определение массы органов.
№п/пМасса тела, мгМасса сердца, мгМасса печени, мгМасса легких, мгМасса почек, мгМасса селезенки, мг
125002581905256375240
Опыт №2 (15.01.2004). Ввели внутрибрюшинно 6-ти мышам экстракт в дозе 7400 мг/кг. Через 2 суток погибло 4 мыши, через 5 суток – 1 мышь, через 12 суток – 1, всего погибло 6 мышей. Определение массы органов.
№п/пМасса тела, мгМасса сердца, мгМасса печени, мгМасса легких, мгМасса почек, мгМасса селезенки, мг
135002252869276341269
Опыт №3 (18.01.2004). Ввели внутрибрюшинно 6-ти мышам экстракт в дозе 1850 мг/кг. Через 2 суток погибло 3 мыши. Определение массы органов.
№п/пМасса тела, мгМасса сердца, мгМасса печени, мгМасса легких, мгМасса почек, мгМасса селезенки, мг
136002161988328820294
Опыт №4 (19.01.2004) Ввели внутрибрюшинно 6-ти мышам экстракт в дозе 740 мг/кг. Все мыши выжили. Опыт №5 (20.01.2004). Ввели внутрибрюшинно 1-ой мыши экстракт в дозе 74 мг/кг. Мышь выжила. Определение массы органов.
№п/пМасса тела, мгМасса сердца, мгМасса печени, мгМасса легких, мгМасса почек, мгМасса селезенки, мг
1200012289918021365
3. Полученные результаты. Расчеты ЛД50.

Экстракт №1

(спиртовой с трехкратной очисткой ацетоном).
Доза, мг/кг87517503500700010500
Выжило64210
Погибло02456
Z134.55.5
d875175035003500
Z × d87552501575019250
Вывод: опыт показывает, что ЛД100 = 10500 мг/кг, учитывая, что m = 6, по вышеприведенной формуле получаем ЛД50 = 3646 мг/кг . Экстракт №2 (действующее начало, выделенное из корня молочая Палласа).
Доза, мг/кг7401850370055507400
Выжило63210
Погибло03456
Z1.53.54.55.5
d1110185018501850
Z × d16656475832510175
Вывод: опыт показывает, что ЛД100 = 7400 мг/кг, учитывая, что m = 6, по вышеприведенной формуле получаем ЛД50 = 2960 мг/кг . Коэффициент массы тела к массе органа
Доза, мг/кгсердцепеченьлегкоепочкиселезенка

Экстракт №1

7000 n=4

16, 4±0,534,0±2,459,47±1,26,67±0,312,9±3,4
350013,72,087,46,19,8
1750 n=216,1±1,252,27±0,659,5±0,938,38±0,418,8±3,75
87,518,42,164,567,832,8

Экстракт №2

7400

15,51,212,710,313,0
37009,681,39,76,610,4
185016,61,810,94,412,2
74,016,52,211,19,430,7
Контроль n=6 18,8±0,611,95±0,0910,8±1,586,9±0,3722,1±1,38
Выводы: 1. Экстракт №1 обладал выраженной органотоксичностью: в дозе 7000 мг/кг на 105% увеличевался коэффициент массы (Кm) печени и на 41,6% снижался Кm селезенки, а в дозе 3500 мг/кг снижались Кm сердца на 27%, легкого на 31,5%, селезенки – на 55,7%. В дозе 1750 мг/кг Кm почек увеличивался на 21,5%. 2. Экстракт №2 в дозе 7400 мг/кг повыщал Кm почек на 49% и снижал Кm печени на 38,5%. В дозе 3700 мг/кг отмечается снижение Кm сердца, печени и селезенки на 48,5%, 33,4% и 53% соотоветственно. В дозе 1850 мг/кг снижались Кm почек на 36% и селезенки на 45%. 4.Патоморфологические изменения органов Экстракт Молочая Палласа (№1, №2) в высоких дозах (7400, 7000, 3700 и 3500 мг/кг) вызывал значительные деструктивные изменения в органах. Печень - дискомплексация печеночных балок, полиморфизм гепатоцитов, очаги гидропической жировой дистрофии гепатоцитов. На отдельных участках очаги некроза, в участках некроза аргирофильная строма разрушена, видны скопления макрофагов, лимфоцитов, нейтрофилов. Портальные тракты отечны, незначительная гиперинфильтрация с очаговым склерозом, полнокровие центральных междольковых вен. Почечные вены с явлениями лейкостаза. Почки - почечная вена полнокровна с явлениями лейкостаза, очаговой ишемии, чередуются с очагами венозного полнокровия. Субкапсулярное мелкоочаговое кровенаполнение из скоплений плотных эритроцитарных масс оранжево-коричневого цвета с частичным гемолизом, строма отечна. В коре местами сохраняется строение извитых канальцев с паренхиматозной дистрофией выстилающего эпителия, с сохранением ядер. Кое-где отмечается лизис эндотелия извитых канальцев с исчезновением ядер, плазморексисом, исчезновением очертания клеток, отдельных канальцев. Тяжелый нефронекроз с формированием гиалиновых цилиндров в просвете прямых канальцев. Миокард - в просвете желудочков - эритроцитарный сверток. Дистония интрамуральных сосудов с полнокровием венул, артериолы пусты, неравномерное кровенаполнение капилляров. Зернистая дистрофия кардиомиоцитов, умеренный межуточный отек. Очаги зубчатой и дугообразной извитости мышечных волокон. Эпикард в виде тонких соединительных пластинок с полнокровными коронарными сосудами. Селезенка - синусы красной пульпы пусты, расширены с неравномерным кровенаполнением. Лимфоидные фолликулы большей частью с нечеткими контурами. Гистеоцитоз синусов. Легкие - отдельные крупные бронхи спазмированы в виде гафрированной трубки, остальные расширены. Мерцательный эпителий десквамирован, бокаловидные клетки заполнены секретом. Очаговый отек с геморрагическим пропитыванием, видны отдельные эритроциты. Неравномерное кровенаполнение периваскулярных и перибронхиальных сосудов легких. Скопление клеток гистеоцитарного ряда. Очаговая эмфизема, очаги дискоидных и пластинчатых ателектазов. Альвеолярный эпителий с частичной десквамацией. Надпочечники - у края почки неравномерно выраженная атрофия коры за счет истончения клубочко-пучковой зоны. В наиболее сохранившихся участках вакуолизация клеток. Строма умеренно отечна, запустевание сосудов. 5.Выводы: 1. Экстракт №1. В опыте выявлены следующие дозы: ЛД100 = 10500 мг/кг, ЛД50 = 3646 мг/кг. 2. Экстракт №2. В опыте выявлены следующие дозы: ЛД100 = 7400 мг/кг, ЛД50 = 2960 мг/кг. 3. Органотоксичность экстракта №1 наиболее выражена в дозе 7000 мг/кг и 3500 мг/кг на органы: печень, сердце, легкие, селезёнку. 4. Органотоксичность экстракта №2 наиболее выражена в дозе 7400 мг/кг и 3700 мг/кг на органы: печень, сердце, почки, селезёнку. 6.Библиография. 1.Атлас лекарственных растений СССР, Москва,1962г. 2.Баньковский А.И., Зарубина М.П., Сергеева Л.Л. «Исследование растений, применяемых в народной медицине, на содержание алкалоидов» Труды ВИЛАР, 9 Москва 1947г. с.119-178 3.Блинова К.Ф., Стуцкий К.Л. «Качественное фитохимическое исследование некоторых растений тибетской медицины Забайкалья» Сообщение 1 Сб. «Вопросы фармакогонозии» №1, ЛХФИ, Ленинград,1961г. с.135-155 4.Буданцева А.А. «Дикорастущие полезные растения России» Санкт Петербург, Издательство СПХФА, 2001г.-663с. 5.Гейссман Т. «Антоцианы, ауроны, флавоны и родственные им водорастворимые растительные пигменты. Биохимические методы анализа растений» Москва, 1960г. с.453-519 6.Дулепова Б.И., Касич В.Б., Попова О.А., Уманская Н.В. «Лекарственные растения Забайкалья» (методические рекомендации) Чита, 1991г. 7.Дулепова Б.И., Касич В.Б., Остроумов В.М., Попова О.А., Уманская Н.В., Филлипова В.Г., Гурова Н.Ю «Каталог редких и исчезающих растений Восточного Забайкалья» Чита, 1991г. 8.Ермаков А.И. «Метод определения гликозидов в растениях» Труды ВИЛАР, 10 Москва, 1959г. с.127-137 9. Землинский С.Е. «Лекарственные растения СССР» Москва,1958г. 10.Каталог лекарственных растений природной флоры Восточного Забайкалья. Чита, 1988г.-60с. 11.Каталог лекарственных растений Читинской области (из гербария Читинского краеведческого музея), Чита 1990г.-136с. 12.Лекарственно-техническое сырье (каталог). Москва, ЦРИБ, 1978г.-182с. 13. Методика определения запасов лекарственных растений. Москва,1986г.-51с. 14. Петряев Е.Д. «Лекарственные растения Забайкалья» ЧИТГИЗ,1952г. с.106-108. 15.Семенов С.Р., Телятьев В.В. «Лекарственные растения Восточной Сибири» Иркутск, Восточно-Сибирское издательство, 1966г. с.190-191. 16.Телятьев В.В. «Целебные травы Восточной Сибири» Иркутск,1976г. 17.Телятьев В.В. «Полезные растения Центральной Сибири» Иркутск,1985г. 18.Тутельян В.А., Суханов Б.П., Австриевских А.Н., Позняковский В.М. «Биологические активные добавки в питании человека» Издательство Научно- технической литературы, Томск 1999г.-296с. 19.Шмидт О. «Природные дубильные вещества. Биохимические методы анализа растений» Москва, 1960 с.539-577 20. Лойт А.О., Савченков М.Ф. «Токсикологическая оценка новых химических веществ», часть I, Иркутск, Издательства Иркутского университета, 1992, с.74- 83 21. Гуськова Т.А. «Доклиническая оценка безпасности лекарственных средств различных фармакологических групп». В журнале «Новые препараты в фармакологии», Москва,2003, №9.